La vitrificación / desvitrificación de ovocitos es una técnica innovadora y que, a simple vista, está proporcionando mejores resultados que la congelación lenta. Es por esto que en este estudio se realiza una comparación de diferentes parámetros como son la supervivencia ovocitaria, tasa de fecundación, forma de desarrollo embrionario, formación del huso meiótico y alineamiento cromosómico, todo ello tras la congelación y descongelación lenta de ovocitos en uno de los casos y la vitrificación / desvitrificación de gametos femeninos, en el otro de los casos.
Las evidencias de este estudio concluyen lo que se presupone a priori: la vitrificación está siendo superior con diferencias significativas respecto al método de congelación lenta, pudiendo deberse a que el método de congelación rápida daña el huso y el alineamiento cromosómico de una forma bastante menor que en el método lento.
INTRODUCCIÓN
Mujeres que no tienen pareja, o si la tienen, no es pareja masculina, que están en riesgo de perder la funcionalidad ovárica por padecer algún tipo de enfermedad, bien sea pélvica, que necesite cirugía o incluso radioterapia – quimioterapia, aquellas parejas con problemas de fertilidad que tengan objeciones morales a la hora de congelar embriones… todas estas, son algunas de las causas por las que es necesario conservar los ovocitos.
Un buen programa de criopreservación ovocitaria sería necesario en estos casos, además, y sobre todo, para los programas de ovodonación entre donantes y receptoras. Puesto que el tiempo corre en nuestra contra en la mayoría de los casos y el realizar todos estos procesos de forma natural es bastante complicado, por no decir a veces, imposible, el tener un protocolo de criopreservación efectivo es primordial para poder dar solución, o al menos intentarlo, a todas estas indicaciones mencionadas.
El número publicado de recién nacidos por métodos de congelación lenta comunes ha sido bastante reducido, aunque al producirse determinadas variaciones en los protocolos de congelación, se han mejorado mínimamente las tasas de nacidos tras congelación-descongelación lenta. A pesar de esto, el porcentaje sigue siendo muy bajo, siendo el principal problema la baja tasas de supervivencia de los ovocitos por el método de congelación lenta convencional.
OBJETIVOS DEL ESTUDIO
De momento, no existe ningún estudio que haya comparado la congelación – descongelación lenta con la vitrificación – desvitrificación de ovocitos con respecto al porcentaje de supervivencia ovocitaria, desarrollo embrionario y tampoco para la estructura del huso meiótico y la configuración cromosómica. Es por esto que este estudio tiene como objetivos principales:
Comparar las tasas de supervivencia ovocitaria, fecundación y desarrollo embrionario en ovocitos humanos congelados y descongelados mediante dos métodos diferentes, lento (congelación lenta) y rápido (vitrificación).
Comparar la estructura del huso meiótico y el alineamiento cromosómico de los ovocitos tras su descongelación mediante estos dos métodos.
PROCEDENCIA DE LOS OVOCITOS para el estudio
Los ovocitos que se incluyeron en el estudio, provenían de pacientes, previamente informadas, a las que se les había sometido a un ciclo de fecundación in vitro mediante microinyección espermática (ICSI). Se utilizaron dos protocolos de estimulación de la ovulación, el largo (con agonistas de la GnRH) y también mediante antagonistas de la GnRH.
Una vez obtenidos los ovocitos se denudaron por dos métodos conjuntos: mecánico, gracias al calibre cada vez menor de pipetas de cristal estiradas a la llama, y enzimático, mediante la hialuronidasa que rompe los enlaces de los complejos cúmulo-ovocitos. La madurez de los mismos se determinó mediante la presencia del cuerpo polar. En el caso de obtener más de 15 ovocitos maduros, los sobrantes se incluyeron en el estudio.
Un total de 111 pacientes participaron en el estudio, recolectando 605 ovocitos. Estas pacientes fueron las que decidieron si congelaron sus ovocitos excedentes de forma lenta o rápida; además de darles las opciones en el consentimiento informado, que todas firmaron, de poder utilizarlos en un futuro, donarlos a la investigación sin inseminarlos, donarlos a otras parejas en caso de quedar gestante o no querer utilizarlos ellos mismos.
Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui.
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE LOS OVOCITOS
Se realizó la congelación-descongelación lenta modificada de los ovocitos o bien, la vitrificación-desvitrificación de ovocitos. En el artículo “Congelación de óvulos” se explica de manera detalla el proceso que se siguió paso por paso en este estudio para realizar la congelación y posterior descongelación de ovocitos o, por el contrario, la vitrificación y desvitrificación de ovocitos.
Todos los ovocitos se descongelaron el mismo día, independientemente del modo de congelación que hubieran seguido.
ANÁLISIS DE OVOCITOS DESCONGELADOS Y DESVITRIFICADOS
Estas técnicas, fijación y marcado inmunofluorescente de tubulina y cromatina, se adaptaron de publicaciones que se habían realizado anteriormente.
Se analizaron 18 ovocitos en fresco (como control), 64 descongelados lentamente y 62 desvitrificados y tras realizarles todo el protocolo adecuado, se visualizaron con un microscopio de láser confocal para analizar los husos meióticos y alineaciones cromosómicas y la placa metafásica. Se consideraron como ovocitos normales solo los que presentaban los husos meióticos y alineaciones cromosómicas normales, aquellas en forma de barril y placa metafásica intacta.
Todos estos procedimientos, se estudiaron estadísticamente mediante el SPSS 13.0 y la chi-cuadrado (X²), considerando como estadísticamente significativos aquellos datos con p< 0,5.
FECUNDACIÓN DE LOS OVOCITOS Y CULTIVO EMBRIONARIO
De los 605 ovocitos incluidos en el estudio, tan sólo sobrevivieron 343, a los que se les hizo ICSI, con el semen de la pareja de la mujer receptora de los ovocitos. No se usó semen de donante en ningún caso.
Tras la microinyección espermática se pasaron a cultivo con un medio secuencial (G-1) durante 3 días, posteriormente se cambiaron de medio de cultivo (G-2) hasta día +5 de desarrollo embrionario, momento en que se transfirieron al útero. Las condiciones de cultivo embrionario fueron de 37ºC en un incubador estanco, con el 5% de CO² y elevado nivel de humedad.
A las 17-19 horas post-ICSI se valoró la fecundación de los óvulos.
La calidad embrionaria se valoró en día +3 de desarrollo según Tomas y col. y se consideraron tan sólo embriones de buena calidad, los de grado I y II, siendo la clasificación seguida como se presenta:
Grado I: Las células o blastómeras del embrión eran de igual tamaño y en el interior del citoplasma no se observaba fragmentación.
Grado II: Las blastómeras era de igual tamaño aunque el embrión presentaba menos de un 20% de fragmentación.
Grado III: Las blastómeras tenían diferentes tamaños y existía menos de 20% de fragmentación.
Grado IV: Las blastómeras eran de igual o diferente tamaño y había entre un 20-50% de fragmentación.
Grado V: Las blastómeras tenían igual o diferente tamaño y el interior del citoplasma presentaba más del 50% de fragmentación.
En día +5 de desarrollo embrionario se valoró si los embriones habían llegado al estadio de blastocisto, pudiendo encontrarse en alguna de las siguientes etapas:
Blastocisto temprano.
Blastocisto expandido.
Blastocisto eclosionado.
Sólo se descartaron aquellos que no poseían masa celular interna. En los casos que hubo embriones excedentes, estos se volvieron a vitrificar para uso posterior.
Vida que une corazones 